Laterale ultrasensibile

May 02, 2023

Nature Biomedical Engineering (2023) Citare questo articolo

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I test a flusso laterale (LFA) sono rapidi e poco costosi, ma sono quasi 1.000 volte meno sensibili dei test di laboratorio. Qui mostriamo che i nanotubi d'oro fluorescenti coniugati con anticorpi plasmonici attivi possono rendere ultrasensibili gli LFA convenzionali. Con tempi dal campione alla risposta entro 20 minuti, gli LFA potenziati plasmonicamente letti tramite uno scanner a fluorescenza da banco standard hanno ottenuto miglioramenti di circa 30 volte nel range dinamico e nei limiti di rilevamento rispetto ai test immunoassorbenti legati a enzimi gold standard della durata di 4 ore, e ha raggiunto una sensibilità clinica del 95% e una specificità del 100% per gli anticorpi nel plasma e per gli antigeni nei tamponi nasofaringei di soggetti affetti da sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Miglioramenti comparabili nelle prestazioni del test possono essere ottenuti anche tramite uno scanner portatile poco costoso, come mostriamo per il rilevamento dell’interleuchina-6 in campioni di siero umano e della proteina nucleocapside di SARS-CoV-2 in campioni nasofaringei. Gli LFA potenziati plasmonicamente superano i test di laboratorio standard in termini di sensibilità, velocità, range dinamico, facilità d'uso e costi e possono fornire vantaggi nella diagnostica point-of-care.

I test a flusso laterale (LFA) sono tra i metodi diagnostici point-of-care (POC) più semplici, rapidi ed economici e offrono un ampio potenziale per lo screening delle malattie a livello di popolazione1,2. Sebbene siano stati introdotti numerosi LFA per gli anticorpi3,4,5 e gli antigeni6,7 della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2), nessuno ha sensibilità e quantificazione paragonabili alla diagnostica di laboratorio come la PCR in tempo reale con trascrizione inversa (RT–PCR) e test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)8,9,10. In generale, gli LFA colorimetrici convenzionali sono circa 1.000 volte meno sensibili di questi test di laboratorio standard11,12 e la diagnosi utilizzando gli LFA richiede un ulteriore test di conferma di laboratorio per stabilire correttamente i risultati negativi. Gli LFA colorimetrici sono spesso inadeguati per letture quantitative, a causa dei limitati cambiamenti di colore rispetto alla variazione della concentrazione dell'analita target13.

La pandemia della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) ha evidenziato la necessità di migliorare le zone svantaggiate per diagnosi cliniche precise e rapide, screening di massa e studi epidemiologici14,15. La RT-PCR16,17 e i test antigenici diretti18,19 sono stati il ​​pilastro per la diagnosi di COVID-19 e i test sierologici sono importanti per la determinazione dello stadio dell’infezione e dell’efficacia del vaccino e per gli studi epidemiologici3,20,21. Questi test diagnostici sono disponibili solo in laboratori microbiologici qualificati e dipendono dagli esperti, richiedono molto lavoro e molto tempo. Queste limitazioni hanno precluso l’esecuzione di milioni di test al giorno necessari durante le impennate epidemiologiche22,23. Pertanto, esiste un bisogno fondamentale di strumenti diagnostici e di screening che non siano solo accurati quanto i test di laboratorio, ma che siano anche rapidi, facili da usare, poco costosi, prontamente disponibili (per uso domiciliare e POC) e scalabili per una popolazione rapida. screening di livello.

Gli sforzi per migliorare le prestazioni bioanalitiche degli LFA hanno incluso l'uso di molecole fluorescenti o punti quantici come elementi reporter24,25. Sebbene i reporter fluorescenti migliorino la quantificazione, la loro intensità di segnale relativamente debole limita la loro sensibilità e utilità diagnostica POC, e il loro basso assorbimento di luce rispetto alle nanoparticelle di oro colloidale convenzionali (AuNP)26 preclude il rilevamento visivo diretto consentito dagli LFA convenzionali. Inoltre, richiedono l'uso di lettori LFA con rilevatori altamente sensibili o potenti sorgenti luminose di eccitazione. Queste considerazioni limitano l'utilità degli LFA fluorescenti nello screening di massa e in contesti con risorse limitate10.

Prevediamo un LFA "bimodale" in cui uno screening iniziale può essere eseguito con un test visivo e i successivi test quantitativi possono essere eseguiti quando necessario sulla stessa striscia LFA utilizzando un lettore a fluorescenza. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo utilizzato un costrutto fluorescente ultraluminoso su scala nanometrica che abbiamo recentemente introdotto27, chiamato fluor plasmonico, come reporter colorimetrico e fluorescente bimodale nelle LFA (Fig. 1a). Questi costrutti su scala nanometrica sfruttano la fluorescenza potenziata dal plasmone28,29,30,31,32 per ottenere un segnale di fluorescenza quasi 7.000 volte più luminoso rispetto ai fluorofori molecolari convenzionali. Abbiamo coniugato fluor plasmonici con anticorpi di rilevamento e li abbiamo utilizzati per consentire il rilevamento colorimetrico e fluorescente rapido e ultrasensibile degli analiti, utilizzando l'interleuchina-6 umana (IL-6) (limite di rilevamento (LOD), 93 fg ml−1), SARS-CoV -2 anticorpi S1 (subunità della proteina spike) (LOD, 185 pg ml−1) e antigene SARS-CoV-2 (proteina nucleocapside (N)) (LOD, 212 pg ml−1). Abbiamo convalidato l’efficacia clinica degli LFA a base di fluoro plasmonico (p-LFA) testando campioni di plasma, siero e tamponi nasofaringei (NP) per il rilevamento di anticorpi SARS-CoV-2 S1, IL-6 e SARS-CoV- 2 antigene, rispettivamente, e hanno raggiunto un'elevata specificità e sensibilità clinica. Dimostriamo anche la capacità quantitativa di p-LFA utilizzando uno scanner portatile auto-progettato compatibile con il fluor plasmonico per dimostrare la sua versatile applicazione POC. In sostanza, questa tecnologia può essere facilmente utilizzata come alternativa a un test di laboratorio per la diagnosi di infezioni patogene clinicamente rilevanti.